分子生物学基本实验操作.ppt

1、分子生物学基本实验操作,周正峰 09.7.19,克 隆 操 作,HEADLINE,PCR 技术,实验中一些好的习惯,1,2,3,4,核 酸 抽 提,1 核酸抽提,1.1 总RNA抽提,1.1.1 原理,利用强变性剂异硫氰酸胍迅速裂解组织（或细胞），促 使核蛋白与核酸的解离，并迅速抑制细胞内的RNA 酶；经 酸性苯酚-氯仿抽提，异丙醇沉淀可获得完整的RNA,1.1.2 相关器皿的处理,1.1.2.1 塑料制品的处理,已经标明RNase-Free的塑料制品，如果没有开封使用过，可以直接使用。对于国产 塑料制品，都必须处理方可使用，步骤如下： 1）在玻璃烧杯中注入双蒸水，加入DEPC使其终浓度为0.

2、1%，磁力搅拌0.5小时； 2）用1）浸泡需要处理的塑料制品，在通风橱中处理过夜； 3）弃将DEPC水，用铝箔封住处理过的塑料制品，高温高压灭菌至少30 min； 5）100烤至干燥，置于干净处备用。枪头必须在无菌操作台中，用镊子装入枪头 盒,1.1.2.2 玻璃和金属制品的处理,用去离子清洗干净，用锡箔纸包好，然后至烘箱中250烘烤3小时以上 或者180烘烤8小时以上,1.1.2.3 电泳槽的处理,用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满 3%的H2O2溶液，于室温放置 10 分钟，最后用 0.1%DEPC水彻底冲洗电泳槽,1.1.2.2 其他,RNA酶很难被

3、灭活，实验过程中要时刻注意防止RNA酶污染。 实验操作者的手也是RNA酶最主要的潜在污染源之一，因此，在实验准备和 RNA抽提过程中，都应戴手套，并尽可能勤换手套。 实验室RNA相关实验用的仪器及试剂应该专用，包括移液器、玻璃器皿、塑料制 品和电泳槽等，并存放在指定地点,1.1.3 总RNA抽提步骤,匀 浆,相 分 离,溶 解,沉 淀,洗 涤,质 量 检 测,1.1.3.1 匀浆,匀浆,米粒大小的组织加入100微升Trizol ，冰上充分研磨至看不见块状的 组织，再补加900ul Trizol 至1ml（适用肝、肾等组织,悬浮细胞,贴壁细胞,细胞,液 氮,研磨棒,组织,倾去培养基，按10cm

4、dish /ml的比例直接将Trizol加入到培养皿中消化、裂解细胞，用RNAse free的枪头吹打数次，将样品转入无RNA酶的EP管中,用液氮预冷研钵，将绿豆大小的组织直接置于液氮中敲碎，并迅速研磨至 粉末状，小心转移至1ml Trizol中。在研磨的过程中，应不断补加液氮， 直至样品成粉末状（适用于心、胃、主动脉等组织,4 2 000g 离心5分钟收集细胞，用Trizol重悬、裂解，每1ml Trizol可裂解5-10*106个细胞,1.1.3.2 相分离,1）匀浆好的组织，室温下静置5-10 min以充分裂解，4、16000rpm离心10min， 取800微升上清液转入一个无RNA酶的

5、EP管中；若为细胞样本，可以省略此步， 直接进行下一步操作； （2）按照1ml Trizol加入200l氯仿，用手剧烈振荡混匀15-30S后室温静置10-15 min， 直至出现较为明显的分层； （3）4，16000 r/min离心15 min，小心吸取上层水相于一新管。 *千万不可吸取到中间界面，一般吸取300微升上清，所得RNA产量足以进行一般的 后续实验，过多上清很容易造成DNA污染,1.1.3.3 RNA沉淀,4) 加入等体积异丙醇，轻轻混匀，室温静置10 min； (5) 4，12000 rpm离心10min，弃上清，此时可见RNA沉淀于管底。在离心之前， RNA沉淀是不可见的，常常

6、在离心管的边缘或者底部形成凝胶状小球,6） 加入1ml 75%DEPC-乙醇，悬浮沉淀； * 此步一定要将RNA沉淀悬浮起来，才能保证残留的盐被洗去 （7）4，12000 rpm离心5 min，弃上清，室温晾干，或者真空干燥510 min，视 沉淀量的多少加入DEPC- ddH2O溶解RNA，可用枪吹打数下以助RNA溶解； * 沉淀不要过于干燥，否则将会大大降低RNA的溶解度,1.1.3.4 RNA 洗涤、溶解,1.1.3.5 RNA质量检测,1）完整性：可以用普通琼脂糖凝胶电泳分析RNA的质量。电泳所用的缓冲液 必须是新配置的。如果电泳可见28S和18S两条主要条带，以及5S的带，并且 28

7、S的亮度在18S的两倍以上，认为RNA的质量很好。 * RNA上样量应控制在300-400ng左右，过多或过少都影响电泳效果,1.1.3.5 RNA质量检测,2）纯度和产量分析：计算A260/A280的比值R来判定RNA的纯度： 用DEPC- ddH2O溶解RNA，1.61.8时，说明RNA降解比较明显。 根据1A260单链RNA=40ng/ul计算RNA产量,1.1.3.6 RNA样本的保存,将质检过关的 RNA标本编号，贴标签，置于-80保存。做好RNA标本 的贮存登记、RNA提取实验记录、RNA质量鉴定记录等，并由专人统一 保管,1.2 基因组DNA的抽提,1.2.1 原理,酚-氯仿法提

8、取 DNA原理为在EDTA（螯合二价阳离子以抑制DNase）存在的 情况下，用蛋白酶K消化真核细胞或组织，用去污剂 SDS溶解细胞膜并使蛋白质 变性，通过酚氯仿法去除蛋白质，而保留 DNA 于水相溶液，最后通过无水乙 醇和高盐溶液沉淀基因组DNA,1.2.2 基因组DNA的抽提步骤,匀 浆,相 分 离,溶 解,沉 淀,洗 涤,质 量 检 测,1.2.2 基因组DNA的抽提步骤,匀浆,绿豆大小的组织加入100微升裂解液，充分研磨至看不见块状的组织，再补加900ul 裂解液至1ml（适用肝、肾等组织），55裂解过夜,悬浮细胞,贴壁细胞,细胞,液 氮,研磨棒,组织,倾去培养基除，PBS洗涤细胞1-2

9、次，按10cm dish /ml的比例直接将裂解液加入到培养皿中消化细胞，用枪头吹落细胞，转入EP管中55裂解过夜,取黄豆大小的组织于盛有液氮的研钵内迅速研磨至粉末状。在研磨的 过程中，不断补加液氮，直至样品成粉末状（适用于心、胃等组织）， 将其小心转入装有1ml裂解液的EP管中，55裂解过夜,4 2 000g 离心5分钟收集细胞，PBS重悬浮洗涤细胞，按照 1-5*107的比例加入裂解液，悬浮细胞，55裂解过夜,1.2.2基因组DNA抽提步骤,2）匀浆裂解过夜的样本应清亮透明。加入等体积Tris-饱和酚，轻轻颠倒，充分混 匀形成乳浊液，此步将离心管置于旋转器上，慢慢混匀10-30min； （

10、3）室温，12000rpm，离心10min，取上清； （4）加入等体积的酚-氯仿，轻轻颠倒混匀； （5）室温，12000rpm，离心15min，小心取出上清,1.2.2基因组DNA抽提步骤,6）加入1/10体积的3M醋酸钠 (pH5.2)和2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，此时可 见絮状沉淀析出，置-80冰箱30min； （7）12000rpm 离心 15 min，小心倾去上清； （8）加入1ml 70%乙醇，悬浮沉淀； （9）4，12000 rpm离心5 min，弃上清，室温晾干5-10min，视沉淀量的多少加入 灭菌双蒸水溶解DNA沉淀,1.2.3 DNA质量检测,一般将DNA样品稀释50

11、100倍（使OD260值位于0.11.0之间），检测样品的 OD260，OD280，计算其比值R来衡量样品的纯度。一般R1.8，DNA质量较 好；R2.0,表明RNA污染明显；R1.7，表明蛋白质、酚等污染较为明显。根 据1A260双链DNA=50ng/ul，计算DNA产量,质检过关的DNA，若短期内需要进行下一步实验，可以暂存区-20，长期 保存则应置于-80。做好样本贮存登记、具体的实验记录、质量鉴定 记录等，并由专人统一保管,1.2.4 DNA保存,1.3 质粒DNA的抽提,1.3.1 原理,将大肠杆菌悬液暴露于高pH的强阴离子洗涤剂中，细胞壁破裂，染色体DNA及 蛋白质变性，将质粒D

12、NA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细 胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，被SDS所包围，当用钾离子 取代钠离子时，这些复合物会从溶液中进一步有效地沉淀下来，通过离心去除， 利用异丙醇沉淀从上清中获得质粒DNA,1.3.2 质粒DNA的抽提步骤,菌夜重悬,裂解,沉淀，洗涤，溶解,质粒复性，蛋白沉淀,氯仿抽提,质 量 检 测,1.3.2 质粒DNA抽提步骤,1、取2ml过夜培养的菌夜于EP管中，4，离心收集菌沉淀； 2、将细菌沉淀重悬于200l预冷的溶液中，剧烈振荡，使菌体分散混匀； * 一定要使细菌分散均匀 3、加200l新鲜配制的溶液，轻轻颠倒数次混匀（不可剧烈振

13、荡），并将离心 管置冰上2-3min，使细胞壁充分裂解（离心管中菌液逐渐变得透明且粘稠）； *此步时间不宜过长，混匀不能剧烈，否则基因组DNA 断裂，造成污染 4、加入200l预冷的溶液，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上 放置3-5min,1.3.2 质粒DNA抽提步骤,6、加入500l的氯仿，混匀，4，12000rpm离心10min； 7、小心移去上请，加入等体积预冷的异丙醇，混匀，室温放置5min，4， 12000rpm离心15min，可见质粒DNA沉淀； 8、小心弃上清， 1ml预冷的70%乙醇悬浮沉淀，4，12000rpm离心5min，重复此 步一次； 9、室温干燥沉淀5

14、10min，视沉淀多少加入灭菌 ddH2O溶解沉淀,1.3.3 质粒DNA的质量签定,一般将质粒DNA样品稀释100倍，检测样品的OD260和OD280，计算其比值 R来衡量样品的纯度。一般认为R1.8, DNA质量较好；R2.0，表明RNA污 染明显；R1.7，表明蛋白质、酚等污染较为明显。根据1A260双链DNA = 50ng/ul，计算质粒DNA产量,质检过关的质粒，若短期内需要进行下一步实验，可以暂存区-20，长期 保存则应置于-80。做好质粒样本贮存登记、具体的实验记录、质量鉴定 记录等，并由专人统一保管,1.3.4 质粒DNA的保存,2、PCR技术,2.1 原理,2.2 实验室设

15、置,PCR实验操作要求在三个不同的区域内进行，严格预防PCR的污染： 1、标本处理区，包括扩增模版的制备； 2、PCR扩增区，包括PCR反应液的配置和PCR扩增； 3、PCR产物分析区，包括凝胶电泳分析，拍照及胶回收等。 各工作区必须有一定的隔离，各区实验器材需专用，并且各区设置要有一 定的方向性：标本制备PCR扩增产物分析产物处理。 切记PCR扩增产物及产物分析区的器材不要拿到标本处理区和PCR扩增 区,2.3 PCR体系及相关参数的设置,10PCR buffer 5l dNTP Mix(各2.5 mM) 4l 引物P1（10 mM） 1l 引物P2（10 mM） 1l 模板* X l 酶（

16、5U/l） 0.5l 灭菌双蒸水 up to 50l,2.3.1 50l标准PCR反应体系,PCR体系及相关参数的设置,50微升标准PCR反应体系中模板推荐使用量 人基因组DNA 0.1-1 g 大肠杆菌基因组DNA 10-100 ng 质粒DNA 0.1-10 ng,2.3.2 模板使用量,一般模板复杂程度越高，所需模板量越多，合适的模板量需要摸索 条件,2.3.3 PCR相关参数的设置,1) 预变性 一般94 5分钟； (2) 引物退火 根据所设计的引物来决定，一般为55-70； (3) 引物延伸 一般在72进行，延伸时间视扩增片段长短而定，一般1Kb需延伸1min； (4) 循环中的变性

17、 94，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性； (5) 循环数 大多数PCR过程含25-35个循环，过多易产生非特异性扩增； (6) 最后延伸 在最后一个循环后，一般设置一个72，5-15min的延伸步骤，使引物延伸 完全，并使单链产物退火成双链,2.3.4 PCR体系的优化,PCR反应条件视模板、引物的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据 模板来源、目的片段的大小及碱基组成、引物性质等的具体情况摸索出最佳 反应条件。 （1）引物退火温度 退火温度是PCR实验的一个重要参数，对PCR的特异性有很大影响。一般根 据所设计引物退火温度上下5来进行梯度实验，摸索出适合的退火温度； （2）引物浓度

18、引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5M，较高的引 物浓度会导致非特异性产物扩增,2.3.4 PCR体系的优化,3）镁离子浓度 可以从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子浓度梯度实验； （4）循环参数 在PCR的前5-10个循环使用严紧的退火温度，使 特异性产物得到优先扩 增，然后在一个较低的退火温度下反应20-30个循 环；也可以使PCR反应在 一个高的退火温度下开始，然后每个循环降低0.5到2，直到退火温度低 于引物设计温度5,2.3.4 PCR体系的优化,5）热启动 冰上配制PCR反应液，将其置于预热的PCR仪上开始反应；另外还可利用具 有 热启动功能的DNA

19、聚合酶来实现热启动； （6）巢式PCR 对于一些较难扩增的模板，可以进行巢式PCR扩增，以提高特异性和灵敏度。 第一轮是15到20个循环的标准扩增，将扩增所得产物稀释100到1000倍做为模板， 利用巢式引物进行15到25个循环的第二轮扩增,2.3.4 PCR体系的优化,7）其他 对某些结构较为复杂的模板，包括高GC含量的模板，需要添加一些促进剂以获 得特异性的PCR产物，如甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等可以增强PCR的扩增。 为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，一般添加剂的浓度为甘油5%-10，甲酰 胺1%-5%或者DMSO 2%-10%。 此外有市场化的GC rich 的buffer，效

20、果不错,一般都采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析，初步判断产物的特异性。PCR产 物片段的大小应与预计的一致，最终结果的确定还需要测序验证。如果产物特异性 好，5微升检测能看见清晰的带，可以直接将产物送测序，否则必须割胶回收,2.3.5 PCR产物分析,1）PCR所需要的试剂均应在紫外灭菌后的超净工作台或负压工作台配制和分装； （2）不能混用PCR产物分析室的吸头，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶 胶的污染； （3）在打开PCR反应管时应避免产物飞溅，如果溅到手套或桌面上，应立即更换 手套，并用稀酸擦拭桌面,2.3.6 PCR实验操作注意事项,PCR的污染非常可怕，较难消除，尤其是在进

21、行大量PCR实验的时候更容易发 生污染，在实验操作的时候要严格注意以下几点,4）PCR反应较多时，可以将相同组分制备反应混合液，然后分装，这样 既可以避免污染，又可以增加反应的精确度； （5）必须设立阴性对照，尤其是在进行菌落或者菌液PCR验证的时候，如 有可能，应该也同时建立一个阳性对照，这样可以验证PCR反应的可 靠性,2.3.6 PCR实验操作注意事项,6）移液器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用高压处理的加样 器，如果不能高温高压处理，至少PCR操作过程中的移液器应该专用，尤其 是PCR产物分析所用的移液器不能拿到标本处理区和PCR扩增区； （7）在优化实验条件之前，应该注

22、意所剩的PCR试剂是否足够完成后续的实验， 尤其是反应buffer和酶，不能在优化好条件之后更换试剂，这样很可能需重新 摸索条件,2.3.6 PCR实验操作注意事项,3 克隆,3.1 原理,普通DNA聚合酶具有末端转移酶的活性，通常能在PCR产物的3端加上A尾 单核苷酸，从而实现PCR片断与一个具有3-T突出末端的载体连接； 限制性内切酶可识别DNA序列的特定位点并切割DNA产生粘性末端，酶切 后的DNA片段经纯化处理后可以与具有相同粘性末端的载体相连接。连接产物 转化感受态细胞，铺板培养，筛选阳性克隆,3.2 克隆步骤,3.2.1 载体和目的片段的酶切,1）限制性内切酶反应在灭菌的PCR管中

23、进行，20l体积反应体系如下： DNA 0.2-2 g 10酶切buffer 2.0 l 酶 1-2 U 加ddH2O 至 20 l 最适酶活温度，酶切2-3小时，割胶回收目的片段。 * 载体酶切好之后，为防止酶切不完全形成自连而影响克隆的筛选，通常需要 一个去磷酸化的处理，用牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）处理载体酶切后的产 物。通常1g量的DNA加入0.5U的CIAP，37处理30min，70灭活 10min，可以防止载体自连,3.2.1 载体和目的片段的酶切,根据酶的用量及酶切的难易程度选择合适的酶切时间，一般酶切2-3小时；为 酶切完全有时也可以酶切过夜，但要注意防止降解； * 多种酶消化

24、时若缓冲液条件相同，可将酶同时加入；否则，先做低温或低盐 的酶切消化，再做高温或高盐的酶切消化； * 注意酶的星号活性,3.2 克隆步骤,3.2.1 载体和目的片段的连接,1） 无菌离心管中加入合适摩尔比的载体和目的片段，通常载体和目标片段 的摩尔比为1：2-10； （2）加入等体积的Solution I连接液，混匀，16反应60分钟，一般连接体系 为10l； * 连接时间根据所插入片段的大小以及酶切情况而定。如果目的片段较大，连 接则需要较长时间；酶切产生平端，应该过夜连接；有些酶虽然酶切产生粘 端，但比一般的粘末端连接效率要低得多，也应该过夜连接，如NdeI, XhoI,3.2.2 连接产

25、物的转化,1）于无菌操作台中，将连接产物加入到100l DH5感受态细胞（预先从- 80冰箱中取出，置冰上溶化），轻轻混匀，冰上放置30分钟； （2）42热击60-90秒钟，迅速于冰中放置3分钟； * 热击时间不可超过90秒，且热击过程中勿动EP管 （3）加入900 l 无抗性的LB液体培养基，37，180rpm 振荡培养1h,3.2.2 连接产物的转化,4）将菌液离心，去掉700l培养基，重新悬浮细菌，涂布于含有相应抗性的 平板； （5）涂布好的板先于37正置培养一段时间，至板上看不见明显的菌液，然 后37倒置过夜培养，形成单菌落； * 一般培养时间不能超过16小时，否则会长出小的卫星菌落，

26、不宜挑出单克 隆,3.2.3 阳性克隆的签定,1）于无菌操作台中，将板上的单克隆接种到3ml含相应抗性的LB培养集中， 37，220rpm，振荡培养过夜； （2）菌液PCR验证初步验证，20l体系如下： 10PCR buffer 2l dNTP Mix(各2.5 mM) 1.6l 上游引物P1（10 mM） 0.8l 下游引物P2（10 mM） 0.8l 菌液 1.5l 酶（5U/l） 0.2l 灭菌双蒸水 13.1 l,3.2.3 阳性克隆的签定,菌液PCR应注意： *上下游引物最好一条来自于载体，另一条为特异性引物； * PCR循环数不宜多，一般25个循 化就行，多了易出现假阳性； *菌落

27、PCR一定要建立阴性对照,3.2.3 阳性克隆的签定,3）将初步确定为阳性的克隆保菌（15%甘油），抽质粒，送样测序； （4）分析测序结果，将阳性克隆质粒及对应的甘油菌编号，贴标签，质粒若短期 内需要进行下一步实验，则可以暂存区-20，长期保存则应置于-80。将 克隆过程中未经测序签定及测序结果不对的质粒及时丢弃，做好质粒样本贮 存登记、克隆的具体实验记录、DNA质量鉴定记录等，并由专人统一保管,3.3 T-A克隆的步骤,1 割胶回收PCR产物，按照凝胶回收试剂盒操作说明进行； * 割胶回收前一定要注意，PCR采用的DNA聚合酶是否有加A功能，如果有，可直 接割胶回收，如果没有，PCR结束后必

28、须进行加A处理，一般50微升的PCR体系 中加入2微升 dNTP，补加0.3微升普通Taq酶，72延伸10min即可； * 为防止污染，电泳缓冲液应该是新鲜配制的；割胶时，应擦净台面，最好用新的 刀片割胶； * 凝胶暴露在紫外下的时间尽可能短，避免造成核苷酸突变,3.3 T-A克隆的步骤,2 连接 （1）无菌离心管中加入0.5l pMD19-T载体和适量的目的片段，通常载体和目标 片段的摩尔比为1：2-10； * 一般情况下，割胶回收后的DNA片段取5l电泳检测，如果能看得见带，加入 4.5l目的片段进行连接，T-A克隆一般都能获得较高的阳性率 （2）加入与(1)等体积的Solution I连

29、接液，混匀，16反应60分钟，一般连接体系 为10l； * 连接时间根据所插入片段的大小情况而定，一般插入片段小于1000bp，连接 1-3小时，较大片段连接过夜,3.3 T-A克隆的步骤,转化、阳性克隆的筛选及保存 转化、阳性克隆的筛选及保存同前述酶切载体和目的片段连接产物的转 化及筛选，只是在涂板的时候要加入40l X-gal(20mg/ml) ，7l IPTG (200mg/ml) 进行蓝白筛选，验证的时候挑取白色菌落进行PCR验证 * T-A克隆一般都能获得较高的阳性率，所以只要取少量菌液涂布，避免长太多克 隆而无法挑菌验证； * 在挑取单克隆之前，可以将培养皿至4放置1-2h，充分显

30、色，让蓝斑更加明显,4 实验中的一些好的习惯,1）实验前认真做好实验设计，实验时不乱想，不聊天，避免加错试剂； （2）枪头头吸完后马上从移液器上取下，以免忙乱的时候又以同一枪头吸取 另一种试剂；移液枪用完之后要调到最大计量的位置，防止久而久之弹簧 失去弹性而影响精确度； （3）所有的试剂都要即时标注好配制日期、药品名称、浓度等； （4） 加试剂之前，先混匀，以免放置时间长了浓度不均； （5） 用完的玻璃器皿，及时清洗，并放入烘箱,4 实验中的一些好的习惯,6）做完实验擦干桌子，一切东西归位，有些东西可以回收利用的就回收，同 时关闭相关仪器； （7）不管大小实验，做完后都要认真做记录，分析实验结果； （8）完成一个实验应及时整理，如阳性质粒，甘油菌等，做好标注及贮存记录； （9） 做好实验室的交流工作； （10）离开实验室前一定要注意水，电是否安全,Thank You